Peroxisomale biogenese-aandoeningen (PBD’s) worden veroorzaakt door mutaties in één van de 16 PEX-genen. Deze genen coderen voor eiwitten die essentieel zijn voor de vorming en het functioneren van peroxisomen — kleine organellen die cruciale metabole functies uitvoeren. Voor een nauwkeurige diagnose en genetisch onderzoek is het essentieel om mutaties in deze genen betrouwbaar op te sporen. Eén van de meest geavanceerde technieken hiervoor is Next-Generation Sequencing (NGS).
Wat is NGS?
Next-Generation Sequencing (NGS) is een technologie waarmee miljoenen stukjes DNA gelijktijdig kunnen worden gesequeneerd. In tegenstelling tot de klassieke Sanger-sequencing, die slechts één fragment tegelijk leest, maakt NGS het mogelijk om hele genenpakketten of zelfs het volledige genoom in één keer te analyseren. Hierdoor kunnen alle PEX-genen tegelijkertijd onderzocht worden.
Hoe werkt NGS voor het opsporen van PEX-mutaties?
De toepassing van NGS voor het detecteren van mutaties in PEX-genen verloopt in de volgende stappen:
-
DNA-extractie
Er wordt DNA geïsoleerd uit bijvoorbeeld bloed of huidbiopt. -
Library-preparatie
Het DNA wordt in kleine fragmenten geknipt en voorzien van adapters voor vermenigvuldiging en herkenning door het sequencer-platform. -
Targetverrijking
Specifieke probes verrijken de exonen van alle 16 PEX-genen, zodat alleen de coderende delen worden gesequeneerd. -
Sequencing
De DNA-fragmenten worden uitgelezen met platforms zoals Illumina, wat leidt tot miljoenen korte sequenties (reads). -
Uitlijning en variantdetectie
Deze reads worden vergeleken met het referentiegenoom. Mutaties worden opgespoord, zoals:- Puntmutaties (SNV’s)
- Kleine inserties/deleties (indels)
- Splice-site mutaties
- Zeldzame of nieuwe varianten
-
Interpretatie van de gegevens
Bio-informatische tools annoteren en interpreteren de gevonden varianten en vergelijken deze met databases zoals dbPEX.
Waarom NGS voor PEX-genmutaties?
NGS biedt talrijke voordelen bij het screenen van PEX-genen:
- Gelijktijdige analyse van alle PEX-genen
- Hoge gevoeligheid voor zeldzame of mozaïekmutaties
- Detectie van onbekende of nieuwe varianten
- Kosten- en tijdbesparend in vergelijking met gen-per-gen analyse
Wat voor mutaties detecteert NGS?
- Missense en nonsense-mutaties
- Splice-site fouten
- Frameshift-mutaties
- Compound heterozygote combinaties
- Zeldzame of unieke DNA-varianten
Praktijkvoorbeeld
Een baby met ernstige hypotonie, hepatomegalie en neurologische symptomen wordt onderzocht met exoom-NGS. Analyse toont twee pathogene varianten in PEX6 aan één reeds gekend bij Zellweger-spectrumstoornissen, de andere een nieuwe mutatie. Hierdoor kan een moleculaire diagnose gesteld worden, met directe implicaties voor behandeling, prognose en genetische counseling.
Conclusie
Next-Generation Sequencing is een onmisbare technologie in de moderne genetica. Voor de diagnose van peroxisomale aandoeningen veroorzaakt door PEX-genmutaties is NGS snel, nauwkeurig en betrouwbaar. Dankzij de hoge dekking en schaalbaarheid is NGS tegenwoordig de standaard voor diagnostiek en onderzoek binnen het veld van de peroxisomale biologie.